熒光顯微鏡的原理

熒光顯微鏡是用人眼不可見的一定波長的紫外線作光源照射被檢物體，使之受激發(fā)后而產生人眼可見的熒光,然后再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大來進行鏡檢。熒光顯微術是生物,醫(yī)學中的重要研究手段，如對生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學等諸方面的鑒定等。

一、熒光

普通光是由發(fā)光體質點的熱運動所引起的輻射；而熒光是非溫度輻射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發(fā)而產生的熒光），放射出熒光（由放射性物質激發(fā)而產生的熒光）。生物熒光（如磷的氧化時發(fā)出的熒光），等等。而熒光顯微鏡則是利用光化熒光這原理設計制造，達到熒光顯微術鏡檢的目的。

由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見的短波光，因而就大大提高了物鏡的分辨率，圖像與背景的反差亦甚為明顯。

二、熒光現(xiàn)象

將熒光物體放到光譜中的各色區(qū)域，就可發(fā)現(xiàn)引起熒光最有效的光線是光譜上波長較短的區(qū)域，即近紫外線區(qū)域，波長約為320-400nm。這種現(xiàn)象的實質是分子吸收了短光的能量（波長越短，光能越強），又以發(fā)光的形式以波長較長和熒光射出，而為人眼可見，這就是熒光現(xiàn)象。熒光接近可見光的紅光端，大部分的熒光現(xiàn)象是符合這一規(guī)律的。

熒光現(xiàn)象可分為兩種：

1. 第一次熒光現(xiàn)象；又稱固有熒光或自發(fā)熒光，當經(jīng)紫外線的照射后，就能發(fā)出熒光的物質；

2. 第二次熒光現(xiàn)象：又稱激發(fā)熒光，當經(jīng)紫外線照射后不能或只部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光素處理，再經(jīng)紫外線照射才能發(fā)生熒光，這是因組織內吸附或溶解有熒光素的緣故。

三、熒光顯微鏡的原理

濾色塊是熒光顯微鏡的重要部位，其核心部件由激發(fā)光濾色片（first barrier filter）、發(fā)射光濾色片（second barrier filter）和半透半反濾色片(beam-splitting mirror)組成。

1．激發(fā)光濾色片及發(fā)射光濾色片：根據(jù)光源和熒光色素的特點，通常選用以下三類配套，提供一定波長范圍的激發(fā)光，并使樣品激發(fā)出的熒光透過，到達目鏡成像。

紫外光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。與之相應的發(fā)射光濾色片可允許藍光通過，視野內的光呈藍色，如應用于DAPI染色。

藍光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使藍光通過，阻擋其他波段的光。與之相應的發(fā)射光濾色片可允許綠光通過，如GFP 染色標記。

綠光激發(fā)：激發(fā)光濾色片使綠光通過，阻擋其他波段的光。與之相應的發(fā)射光濾色片通常可允許紅光通過，如Rhodamine染色。

2．半透半反濾色片：它的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，而將其反射；并透過相應波長范圍的發(fā)射光。其型號與激發(fā)光濾色片和發(fā)射光濾色片相對應。

3. 光路：光線在熒光濾色塊中的傳播光路為：反射光濾光片只允許光源中特定波長的光線透過，這部分激發(fā)光到達半透半返濾色片時被反射后通過物鏡照射到樣品上，樣品中的熒光基團被激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射出長波長的熒光；發(fā)射光通過物鏡，透過半透半反濾色片，到達發(fā)射光濾色片，此時又只有特定波長的光線透過，最后通過目鏡被我們肉眼看到的就是樣品中的熒光了。